INTRODUCCIÓN

Los receptores de tirosina quinasa neurotróficos (Trk) tipo A, B y C son proteínas transmembrana, cuyos ligandos son proteínas involucradas en el desarrollo y función neuronal, denominadas neurotrofinas⁽¹⁾. Estos receptores están codificados por los genes NTRK1, NTRK2 y NTRK3⁽¹⁾.
En condiciones fisiológicas, la unión de las neurotrofinas al dominio extracelular del receptor Trk determina la dimerización del mismo, la autofosforilación y la activación de los residuos tirosina quinasa intracelulares. Esto resulta en la interacción con diversas vías de señalización intracelular, que incluyen MAPK, PLC-gamma o PLC-γ PI3K/AKT, y que tiene efectos estimuladores en la proliferación, diferenciación y sobrevida de neuronas y otros tipos celulares (Figura 1)

Figura 1. Vías de señalización de los  receptores TRK. Los genes NTRK 1, ,2 y 3 codifican para los receptores transmembrana Trk A, B y C, respectivamente. Tras la unión del ligando, los receptores se dimerizan, autofosforlilan y señalizan río abajo, activando las vías MAPK, PLC-gamma o PLC-γ PI3K/AKT. Estas vías se encuentran vinculadas a la sobrevida, proliferación y diferenciación celular. MAPK: vía de las MAP quinasas; PLC: fosfolipasa C; PI3K/AKT: vía de fosfo-inositol-3-fosfato/AKT.

Los rearreglos cromosómicos que involucran el dominio quinasa carboxi-terminal (o 3′) de los genes NTRK 1, 2 y 3 con segmentos amino-terminales de otros genes, originan proteínas quiméricas que fueron identificadas en tejido neoplásico por primera vez en 1982⁽²⁾ y caracterizados en 1986⁽³⁾. Se describieron más de 25 genes que pueden formar parte de las fusiones con el gen NTRK(4,5) (Figura 2).

Las proteínas quiméricas originadas a partir del rearreglo se encuentran constitutivamente activas, lo que determina la señalización independiente de ligando y la oncogénesis. Estos eventos tumorales iniciadores son en general mutuamente excluyentes con otras alteraciones genéticas⁽⁴⁾.
Los rearreglos de NTRK son infrecuentes, y se estima que su prevalencia oscila entre 0,25 y 1% en todos los cánceres humanos⁽⁵⁾. En algunas neoplasias frecuentes del adulto (cáncer de mama, pulmón, colorrectal) se describen con una frecuencia menor a 1%⁽⁶⁾. No obstante, en determinados tipos tumorales inusuales (carcinoma secretorio de mama, fibrosarcoma congénito pediátrico, nefroma mesoblástico congénito, entre otros) son la alteración genética iniciadora predominante^(7-9).

Figura 2. Modelo de génesis de la proteína quimérica ETV6-NTRK3.
Los genes de fusión son la consecuencia de eventos de corte y empalme entre genes independientes. En este caso, los genes ETV6 (localizado en el brazo corto del cromosoma 12) y NTRK3 (localizado en el brazo largo del cromosoma 15) sufren rupturas a nivel intrónico y generan una traslocación.
El gen de fusión resultante (ADN), que cuenta con la porción 5′ de ETV6 y la porción 3′ de NTRK3, codifica para un transcripto de fusión (ARNm).
El ARNm maduro muestra la unión exón-exón entre ambos genes, y el resultado de su traducción es una proteína quimérica (también llamada proteína de fusión) que cuenta con la porción amino-terminal del gen ETV6 y la porción carboxi-terminal del gen NTRK3. ARNm: ARN mensajero.

Las fusiones de NTRK se describieron en carcinoma papilar de tiroides (CPT), carcinoma de células de Hürthle, carcinoma pobremente diferenciado y carcinoma anaplásico⁽¹⁰⁾. En el CPT, los rearreglos de NTRK se detectaron con una frecuencia variable (entre <5 y 25%). Se observaron con mayor prevalencia en la población pediátrica y en pacientes con antecedentes de exposición a radiación⁽¹¹⁾. En el carcinoma anaplásico de tiroides se reporta más raramente (3-5%). Las fusiones más comúnmente detectadas en los carcinomas tiroideos derivados del epitelio folicular involucran solamente a los genes NTRK1 y NTRK3, y comprenden con mayor frecuencia NTRK3-ETV6, TPM3-NTRK1, IRFBP2-NTRK1, TPR-NTRK1, RBPMS-NTRK3, SQSTM1-NTRK1/3 y EML4-NTRK3, entre otros^{(12, 13)}.

Características y comportamiento de los tumores tiroideos con fusiones del oncogén NTRK.
Los CPT con fusiones del oncogén NTRK presentan un patrón de crecimiento predominantemente folicular, con infiltrado linfocitario y elevada frecuencia de compromiso ganglionar. Los tumores que presentan rearreglos NTRK1 muestran mayor prevalencia de multicentricidad e invasividad^(12,13). Las características citomorfológicas incluyen patrones mixtos, con áreas de fibrosis, citoplasma oncocítico o vacuolado, y menos comúnmente, extensas pseudoinclusiones intranucleares^(14,15). Además de la variante papilar también se han descrito casos con morfología de tipo carcinoma secretor, que expresan S100, mamoglobina y GATA3⁽¹²⁾.
El predominio del patrón folicular se observa más frecuentemente en los casos positivos para la fusión NTRK3, mientras que en los carcinomas positivos para la fusión NTRK1 se observan coexistencia de áreas de arquitectura folicular con focos de tipo papilar^(15-17).
Si bien está descripto que los tumores diferenciados con esta alteración molecular podrían tener un comportamiento más agresivo, una reciente revisión de más de 850 pacientes que demostró una prevalencia de fusiones NTRK del 6% (n=59), se asoció a respuestas excelentes en el 57% de los casos con un 25% de respuestas estructurales incompletas y una frecuencia de lesiones metastásicas a distancia del 8%, no muy diferente a

otras series de pacientes con CDT. Los tumores menores de 2 cm de diámetro parecerían tener un buen pronóstico luego del tratamiento convencional (tiroidectomía con o sin administración de radioyodo)⁽¹³⁾.
Los rearreglos de NTRK son blancos terapéuticos accionables. Si bien algunos inhibidores multi-quinasa (IMQ) (como cabozantinib) poseen cierta actividad inhibitoria sobre NTRK, en la actualidad se encuentran disponibles fármacos con acción más específica sobre estos últimos. Larotrectinib es un inhibidor selectivo y potente de las tres proteínas Trk (A, B y C)^(18,19). Entrectinib es un IMQ (eficaz para inhibir a los receptores codificados por los genes NTRK, ALK y ROS1)⁽²⁰⁾. Ambos fármacos fueron evaluados en estudios “basket”, que incluyeron pacientes adultos y pediátricos con tumores que evidenciaron fusiones de NTRK, independientemente del tipo histológico y el órgano de origen.
El estudio fase 2 que evaluó la eficacia y seguridad de larotrectinib incluyó 55 pacientes (5 de ellos con cáncer de tiroides). Se evidenció una tasa de respuesta global de 75% (62% de respuestas parciales y 13% de respuestas completas). Al año de iniciado el tratamiento, se observó que 71% de las respuestas se mantuvieron y 55% de los pacientes no evidenciaron progresión. La sobrevida libre de progresión no fue alcanzada. Los eventos adversos fueron en su mayoría grado 1; menos de 5% de los pacientes presentaron eventos adversos grado 3 o 4⁽¹⁸⁾. Un análisis conjunto de los ensayos clínicos de fase 1 y 2 que incluyó a 159 pacientes con 15 tipos tumorales diferentes (26 de los cuales tuvieron diagnóstico de cáncer de tiroides), confirmó que 79% de los casos presentaron respuestas objetivas al tratamiento, con 16% de respuestas completas. La evaluación de eventos adversos en un total de 260 pacientes que recibieron larotrectinib demostró que las toxicidades de grado 3-4 fueron infrecuentes (incremento de alanino aminotransferasa en 3%, anemia en 2%, y neutropenia en 2%)⁽²⁰⁾. En Argentina se describió el uso de larotrectinib en un paciente con carcinoma papilar de tiroides portador de un rearreglo ETV6-NTRK3, refractario a yodo radioactivo, en el que se logró una respuesta completa (mantenida durante 11 meses)⁽²¹⁾.
El análisis conjunto de tres ensayos clínicos fase 1 y 2 (ALKA 372-001, STARTRK1 y STARTRK2) que evaluaron el uso de entrectinib en 54 pacientes adultos (de los cuales 5 tuvieron diagnóstico de cáncer de tiroides) mostró respuestas objetivas en 57% de los casos (7% respuestas completas y 50% respuestas parciales); 17% de los pacientes tuvieron enfermedad estable. La sobrevida libre de progresión fue de 11 meses. En 22% de los pacientes incluidos en este análisis se constataron metástasis basales en sistema nervioso central; en este grupo la proporción de respuesta al tratamiento fue similar a la del resto de la población tratada. La mayoría de los eventos adversos fueron de grado 1 y 2, y reversibles; los eventos adversos grado 3-4 más frecuentes fueron aumento de peso (10%) y anemia (12%)⁽²⁰⁾.
Los inhibidores selectivos de NTRK de primera generación evidenciaron actividad antitumoral independientemente del tipo de rearreglo de NTRK, del tipo histológico y de la edad del paciente, con un perfil favorable de toxicidad. Esto determinó que la FDA (Food and Drug Administration) en 2018 y la EMA (European Medical Agency) en 2019 otorgaran la aprobación tumor-agnóstica para larotrectinib en pacientes con neoplasias sólidas localmente avanzadas o metastásicas que evidenciaran rearreglos de NTRK, de modo independiente del tipo tumoral y la edad. Posteriormente, similar aprobación fue otorgada a entrectinib por la FDA en 2019, la EMA en 2020 y se espera la aprobación por ANMAT para el corriente año en nuestro país.
El objetivo del presente manuscrito es efectuar recomendaciones para optimizar estrategias eficaces de detección de las fusiones del oncogén NTRK en pacientes con carcinoma de tiroides en Argentina.

Medicina de precisión en oncología tiroidea
Esta terminología se refiere a un modelo médico que propone una adaptación personalizada del cuidado de la salud y que se basa en técnicas moleculares (estudios genómicos y otras –ómicas) para identificar a los pacientes que presentan una alteración molecular accionable y que permite cambiar la evolución de la enfermedad. El hallazgo de fusiones del oncogén NTRK podría implicar un cambio terapéutico en un 2 a un 25% de pacientes con tumores diferenciados de tiroides avanzados refractarios al radioyodo con criterio de inicio de terapia sistémica y en un porcentaje mucho menor de tumores anaplásicos⁽²²⁾.
En cáncer diferenciado de tiroides (CDT), la interrogación genómica debe plantearse en el paciente indicado y en el momento oportuno. Si esta modalidad se utiliza de manera indiscriminada, se corre el riesgo de incrementar gastos en diagnóstico con un bajo rédito en relación al beneficio terapéutico. Por esto, es fundamental definir a qué pacientes, cuándo y cómo se diagnosticará la presencia de esta fusión.

NTRK en CDT y carcinoma pobremente diferenciado de tiroides: a quién evaluar y cuándo.
Los pacientes candidatos a ser evaluados son los que presentan enfermedad localmente avanzada o metastásica a distancia, una vez definida como refractaria al radioyodo. Los criterios de refractariedad al radioyodo pueden observarse en la Tabla 1⁽²³⁾.

Tabla I. Definición de refractariedad al radioyodo.

En CPT o pobremente diferenciado, la mutación iniciadora de la carcinogénesis más prevalente es la del oncogén BRAF (30-70%), por lo que su identificación reduciría de manera relevante el número de pacientes a evaluar en búsqueda de rearreglos de NTRK⁽²⁴⁾ (Figura 3, Figura 4).
En tumores foliculares, las mutaciones más prevalentes, no accionables hasta el momento, son las del oncogen RAS (fundamentalmente NRAS)⁽²⁵⁾. De la misma manera que con los tumores papilares, y considerando que estas alteraciones son mutuamente excluyentes, se podría descartar inicialmente la mutación del oncogén NRAS, seguida de la búsqueda de otras alteraciones genómicas accionables (Figura 3, Figura 4).

Figura 3. Secuencia de pasos propuestos para evaluación de fusiones del oncogén NTRK en pacientes con tumores de tiroides derivados del epitelio folicular. Luego de la selección de pacientes candidatos, se propone un esquema de evaluación molecular en 2 pasos. Teniendo en cuenta que las mutaciones conductoras presentes en los carcinomas de tiroides derivados del epitelio folicular son generalmente mutuamente excluyentes, el primer paso tiene como objetivo identificar pacientes que presenten mutaciones o fusiones de alta prevalencia, según edad e histología, utilizando técnicas relativamente sencillas y/o accesibles. El segundo paso tiene como objetivo la interrogación de fusiones de NTRK en aquellos pacientes negativos para aquellas alteraciones genómicas evaluadas en la instancia previa. RI: radioyodo; qPCR: PCR cuantitativa, PCR en tiempo real; RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa; IHQ: inmunohistoquímica; FISH: hibridación in situ fluorescente; NGS: Next Generation Sequencing, secuenciación masiva paralela.

Figura 4. Algoritmo sugerido para tumores tiroideos derivados del epitelio folicular y cáncer anaplásico de acuerdo a los fármacos aprobados por ANMAT o aquellos pasibles de ser indicados a través del programa de uso expandido o ensayos clínicos disponibles en Argentina (agosto de 2021). MTS: metástasis, RAI-R: resistentes al radioyodo, CPT: carcinoma papilar de tiroides; CFT: carcinoma folicular de tiroides: CPTvF: carcinoma papilar de tiroides variante folicular Ca: carcinoma; EP: enfermedad progresiva; *Lenvatinib como segunda línea de tratamiento si se indicó sorafenib como primera línea. ** Cabozantinib como segunda o tercera línea.

El escenario ideal plantea la evaluación de estas alteraciones al momento de la definición de la enfermedad avanzada localmente o a distancia refractaria al radioyodo no pasible de terapias locales, aún no progresiva. Esto permitiría delinear estrategias terapéuticas en el contexto del hallazgo de alteraciones accionables. (Tabla 2, Figura 2, Figura 4). En pacientes con metástasis en sistema nervioso central, la interrogación genómica debiera garantizarse desde el mismo momento del diagnóstico, ya que el hallazgo de fusiones de NTRK determinaría la elección de larotrectinib o entrectinib como fármacos de primera línea, por su capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica y alta efectividad⁽¹⁹⁾.

Tabla II. Selección del paciente y momento para la interrogación genómica en búsqueda de fusiones del oncogén NTRK.

Si el estudio genómico no puede realizarse en ese momento, una alternativa válida es iniciar una primera línea de tratamiento con un IMQ, al mismo momento en el que se comienza la búsqueda de estos genes accionables.
Es importante considerar que la indicación de los inhibidores de NTRK se debiera realizar en la misma instancia en la que plantearíamos el inicio de IMQ, es decir, en pacientes con enfermedad refractaria al radioyodo, localmente avanzada o metastásica a distancia con enfermedad progresiva en menos de un año, con carga tumoral relevante (en general lesiones con suma de diámetro por arriba de los 2 cm por criterios RECIST 1.1) o lesiones de menor diámetro, pero potencialmente sintomáticas⁽²³⁾. Queda aún por definir la utilidad de estos fármacos como neoadyuvancia pre-cirugía en pacientes con tumores localmente avanzados irresecables y la necesidad de un inicio más temprano. En la Figura 4 se muestra un algoritmo sugerido para tumores tiroideos derivados del epitelio folicular y cáncer anaplásico de acuerdo a los fármacos aprobados por ANMAT o aquellos pasibles de ser indicados a través del programa de uso expandido o ensayos clínicos disponibles en Argentina al momento de la escritura de este manuscrito.

Cáncer anaplásico
El pronóstico y la agresividad de estos tumores debe alentar a la búsqueda inmediata de alteraciones moleculares accionables. En alrededor del 40% de estos pacientes, las mutaciones activantes del oncogén BRAF, presentan una alternativa terapéutica aprobada en nuestro país (la combinación de dabrafenib y trametinib)⁽²⁶⁾. Una vez que se descarta esta alteración, sería correcto identificar otras alteraciones accionables, ya que esto podría cambiar el pronóstico de manera sustancial^(18,19) (Figura 3, Figura 4).

Alteraciones del oncogén NTRK en pediatría.
El CDT es el tumor endócrino más común en la población infanto-juvenil y, al igual que en los adultos, en las últimas décadas se ha observado un aumento en su diagnóstico⁽²⁷⁾. La distribución de la frecuencia de las variantes histológicas de cáncer de tiroides en pediatría se asemeja a la de adultos, con la diferencia que los tumores anaplásicos son extremadamente infrecuentes⁽²⁷⁾.
El CPT en niños difiere clínica, patológica y genéticamente de los tumores en pacientes adultos. Los niños usualmente tienen formas de presentación más agresivas, con mayor riesgo de presencia de metástasis ganglionares al diagnóstico (35 a 70%) y también metástasis a distancia, predominantemente pulmonares (15 a 20%)⁽²⁹⁾, así como un mayor riesgo de enfermedad persistente y/o recurrente, inclusive hasta cuatro décadas luego del diagnóstico⁽³⁰⁾. A pesar de esta mayor agresividad, la supervivencia a 10 años de los pacientes pediátricos con metástasis a distancia es marcadamente superior a la de adultos con la misma situación⁽³¹⁾.
Desde el punto de vista molecular, los rearreglos de RET-PTC son las alteraciones más frecuentemente halladas en tumores papilares en la edad pediátrica (25% a 30%)(32). Por otro lado, los rearreglos de NTRK1 y NTRK3 podrían alcanzar la misma frecuencia (10%, rango: 0%-26%)^(33,34).
En el estudio de Zhao y colaboradores⁽³³⁾ no hubo correlación entre la fusión hallada y los subtipos histológicos evaluados (variantes: esclerosante difusa, mixto folicular-papilar, folicular infiltrante, CPT clásico, y de células altas, entre otras). La mayoría se presentaron con enfermedad invasiva, con infiltración linfovascular, extensión extratiroidea, metástasis ganglionares y metástasis pulmonares⁽³³⁾. Por otro lado, se ha descripto que las fusiones de NTRK1 se presentan en pacientes más jóvenes, con tumores de mayor tamaño, con las variantes clásica y folicular del CPT, multifocales, con invasión vascular y metástasis ganglionares, a diferencia del rearreglo de NTRK3, cuya agresividad no está aún determinada⁽¹³⁾.
En adultos, la refractariedad al radioyodo está claramente definida, así como el momento en el que se debería comenzar una terapia sistémica. Sin embargo, en pediatría no hay consenso respecto a cuándo un paciente debe considerarse como refractario al tratamiento con iodo radioactivo, ni cuál es el criterio para iniciar una terapia sistémica, considerando que ninguno de los IMQ (sorafenib, lenvatinib y cabozantinib) se encuentra aprobados para uso en esta población.
La mayoría del conocimiento del uso de IMQ y su eficacia en pediatría proviene de la experiencia en adultos, que se ha extendido de manera compasiva a la población pediátrica, con poca evidencia en la literatura, con algunos casos reportados con esta terapéutica⁽³⁵⁾.
La interrogación genómica asociada al uso potencial de los respectivos inhibidores selectivos aprobados hasta el momento se plantearía ante la presencia de pacientes con enfermedad invasiva localmente, compromiso de los grandes vasos o con metástasis pulmonares asociadas con hipoxia, así como en la enfermedad progresiva e irresecable, y en los pacientes que reúnen criterios de refractariedad al radioyodo con enfermedad estructural progresiva.
También queda por definir si en pacientes con tumores avanzados localmente, el uso de estos inhibidores selectivos podría tener un impacto en la resecabilidad del tumor primario, luego de su indicación en esta población de pacientes.

Metodología de detección de las fusiones de los genes NTRK.
Como se describió previamente, las fusiones de los genes NTRK son eventos oncogénicos poco frecuentes, lo que plantea una problemática clave para la detección de los pacientes candidatos a recibir el tratamiento adecuado. Entre las variables a considerar en la elección del método de testeo se incluyen: i) el tiempo para obtener el resultado, ii) los costos y iii) el tipo de muestra y cantidad de material disponible en la que se realizará el análisis.
Discutiremos en forma sucinta los diferentes métodos disponibles, sus ventajas y desventajas, comenzando por las técnicas de inmunohistoquímica, luego la hibridación in situ fluorescente (FISH) y por último, la secuenciación masiva paralela, o de segunda generación, (NGS por sus siglas en inglés: Next Generation Sequencing).
Los factores preanalíticos son de crucial importancia en todo procedimiento diagnóstico, y determinan en gran medida la calidad de los resultados obtenidos, entre ellos se consideran la isquemia fría, la fijación, el procesamiento y el almacenamiento de la muestra. Todos estos factores impactan en la calidad del tejido a analizar. Aunque se pueden utilizar diversas muestras frescas o citológicas para el diagnóstico, la muestra que se interroga con mayor frecuencia, dada su disponibilidad y capacidad de almacenamiento, sería el material fijado en formol e incluido en parafina.

Inmunohistoquímica.
La inmunohistoquímica (IHQ) es un método histopatológico basado en reacciones inmunoenzimáticas. Emplea anticuerpos (mono- o policlonales) dirigidos contra antígenos específicos, y enzimas que catalizan la generación de una reacción de coloración (generalmente peroxidasa o fosfatasa alcalina). En la práctica diaria se emplean para determinar los fenotipos o perfiles de expresión proteica de diversos tejidos, sean estos normales o patológicos. Es un método rápido, con un tiempo al reporte de 3-5 días⁽³⁶⁾.
Esta metodología se recomienda como herramienta de tamizaje para detección de las neoplasias con fusiones de NTRK por ser un método ampliamente disponible en los laboratorios de anatomía patológica y por su bajo costo relativo con respecto a las técnicas de secuenciación.
Para la detección de la proteína Trk por IHQ se utiliza un anticuerpo recombinante monoclonal de conejo (clon EPR17341) dirigido contra un dominio común próximo al extremo C terminal de las proteínas TrkA, TrkB y TrkC cuya secuencia no es de conocimiento público (es propiedad de los fabricantes)⁽³⁷⁾. El valor de corte para considerar positivo un resultado es de 1 a 10% de células positivas según la literatura, y es frecuente que la tinción sea heterogénea. El patrón de expresión dependerá del gen fusionado con NTRK. La tinción nuclear es característica y prácticamente diagnóstica de la fusión de ETV6-NTRK3, mientras que la fusión LMNA-NTRK1 muestra tinción perinuclear. las fusiones que involucran a otros genes pueden presentar un patrón citoplasmático granular, citoplasmático difuso o de membrana^(38,39).
Es importante destacar que este anticuerpo (pan TRK, clon EPR17341) detecta tanto proteínas Trk normales como el producto de la fusión de los genes NTRK⁽³⁷⁾.
Adicionalmente, varios tejidos normales presentan expresión basal constitutiva de TRK, como el ovario, testículo, musculo liso y el tejido nervioso, tanto central como periférico. De esto se desprende la nula utilidad de emplear esta metodología en tumores de estos orígenes, ya que no es posible discriminar entre la proteína normal y la generada por una fusión de los genes NTRK.
Además, se han descripto resultados falsos positivos, por ej. en tumores neuroendocrinos.
En todos los casos en el que sospecha una neoplasia se requiere de una prueba molecular confirmatoria⁽⁴⁰⁾.
El anticuerpo anti pan-Trk es una técnica útil para la identificación de fusiones NTRK, con una sensibilidad global de aproximadamente 85-90% y una especificidad del 100% en una gran variedad de tejidos neoplásicos, excluyendo los tumores del sistema nervioso central. La sensibilidad es mayor para las fusiones de NTRK 1 y 2, cercana al 90%. La fusión ETV6-NTRK3 tiene la tasa de detección más baja de cualquiera de las fusiones, con una positividad de solo 50% con las técnicas de IHQ⁽⁴¹⁾.
Con respecto a los carcinomas tiroideos, la IHQ con pan-Trk tiene un valor predictivo positivo de 100%, por lo cual se puede recomendar esta metodología como un primer paso robusto en la selección de pacientes, pero debemos señalar que un resultado negativo no permite descartar absolutamente una fusión de los genes NTRK, dado que la sensibilidad es baja.
En resumen, la IHQ es un método atractivo para el tamizaje, por ser una técnica rápida y de bajo costo, pero un resultado negativo no excluye una fusión NTRK, y un resultado positivo debe ser confirmado con un método molecular complementario.

Hibridación in situ fluorescente (FISH).
Las técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) son técnicas de citogenética que permiten detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en muestras biológicas. Se utilizan para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias (ADN o ARN) específicas mediante el empleo de sondas fluorescentes que se unen a sus blancos complementarios, y que son detectables de manera visual. Las sondas locus específico hibridan en una región de ADN específica del cromosoma, que puede corresponder a la secuencia de un gen o una región mayor, y se utilizan para detectar la pérdida, la ganancia de material genético y para alteraciones estructurales (translocaciones, inserciones, y fusiones, como el caso de los genes NTRK)⁽⁴⁾.
Se pueden utilizar improntas de tejido fresco o bien cortes histológicos provenientes de tejido fijado en formol e incluido en parafina, y tiempo al reporte es por lo general menor a 7 días. Es una técnica con buena sensibilidad y especificidad, siempre que se cuente con patólogos entrenados. Además, al ser una técnica morfológica, permite distinguir las células tumorales de las acompañantes, lo que brinda resultados más sensibles y específicos, incluso en escenarios de baja celularidad tumoral⁽⁴²⁾.
En el terreno de la aplicación de FISH para diagnóstico de neoplasias tiroideas, las sondas que se prefieren son las de tipo locus específico de diseño break apart, que permiten objetivar la separación de regiones del gen evaluado. El objetivo es demostrar translocaciones de las regiones cromosómicas donde se localizan los genes NTRK, a saber: 1q23.1 (NTRK1), 9q21.33 (NTRK2) y 15q25.3 (NTRK3), independientemente de cuáles sean los genes asociados (partners).
Además, se dispone de sondas comerciales, también conocidas como «sondas de fusión» break apart, para los genes más frecuentemente involucrados en los rearreglos con los genes NTRK, como ETV6-NTRK3⁽⁴³⁾.
Un dato importante a tener en cuenta es que la técnica de FISH presenta limitaciones para detectar la mayor parte de los rearreglos intracromosómicos de NTRK1, por lo que, en casos con características histopatológicas sugerentes de esta fusión, se debe proceder a evaluar con otros métodos complementarios de biología molecular. Además de esto, en ocasiones las traslocaciones no son productivas (no generan transcripto funcional ni proteína quimérica), por lo que se reportaron falsos positivos^(42,44).

RT-PCR
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (comúnmente conocida como RT-PCR por su sigla en inglés), es una técnica muy útil para la detección de rearreglos cromosómicos que generen transcriptos de fusión. Sin embargo, existen algunos detalles que vale la pena mencionar en el caso puntual de los rearreglos de genes NTRK^(45,46).
La técnica utiliza ARN como punto de partida, y luego de una retrotranscripción a ADN copia (cDNA en inglés), se amplifican productos específicos (generalmente transcriptos de fusión, en los que existe unión exón-exón entre diferentes genes). Por lo tanto, se deben conocer los genes involucrados y es necesario disponer de una pareja de cebadores o primers para cada transcripto que se quiera evaluar^(42,47).
El ARN puede obtenerse tanto a partir de tejido fijado en formol e incluido en parafina, como de tejido fresco-congelado. Sin embargo, la calidad del ARN obtenido de material parafinado de archivo es en ocasiones limitada⁽⁴⁸⁾. Es una técnica de bajo costo, sumamente específica, con un tiempo al reporte de 3-7 días. Sin embargo, al tratarse de una estrategia dirigida contra transcriptos de fusión específicos, no es un buen método de tamizaje para rearreglos en genes promiscuos que presentan de forma recurrente múltiples compañeros de fusión ^(47-49).
Para el estudio de fusiones de NTRK, este tipo de técnicas tiene relevancia frente a tumores que por lo general muestran de manera recurrente transcriptos de fusión específicos (ej: ETV6-NTRK3 en fibrosarcoma congénito, nefroma mesoblástico congénito, carcinoma secretor de mama y análogo-secretor de glándulas salivares, etc)⁽⁵⁰⁾.
La evaluación de fusiones de NTRK1/2/3 resulta incompleta cuando sólo se interroga el transcripto de fusión ETV6-NTRK3 por RT-PCR. Dado que este tipo de rearreglos se reportaron con mayor prevalencia en carcinomas de tiroides asociados a radiación, podría ser de utilidad ante este tipo de tumores y un resultado negativo no invalida la presencia de otros transcriptos de fusión⁽⁵¹⁾.

Next Generation Sequencing.
La secuenciación de segunda generación (Next Generation Sequencing, NGS) comprende un conjunto de tecnologías que permiten secuenciar gran cantidad de fragmentos de ADN de un modo costo-efectivo comparado con las tecnologías previas (secuenciación de primera generación, Sanger). Dependiendo del abordaje, esta tecnología permite detectar variantes de nucleótido único, inserciones, deleciones y grandes rearreglos o fusiones, como las de los genes NTRK. Además, ya que el material de partida puede ser tejido fijado en formol e incluido en parafina, o tejido fresco, es una técnica con gran flexibilidad y aplicabilidad.
La tecnología NGS ha madurado a lo largo de los últimos años, se ha tornado más accesible, y actualmente se consolida como un método robusto en la clínica para el estudio de gran variedad de tumores. Es capaz de generar resultados confiables en el campo del diagnóstico molecular, en un número cada vez mayor de pacientes. Aún en nuestro país, mayormente debido a sus costos, las indicaciones para su aplicación son restringidas, pero no existen dudas sobre los elevados niveles de sensibilidad y especificidad de sus resultados^(52,53).
El tiempo de respuesta para NGS oscila entre 14 y 21 días, y su implementación conlleva una gran inversión tecnológica, además de una apropiada infraestructura⁽⁵⁴⁾.
Las variantes estructurales, tales como las que dan producto a genes de fusión, pueden ser detectadas tanto con paneles basados ADN o ARN⁽⁴⁰⁾.
Dentro del primer grupo, se debe asegurar que en el diseño del panel se encuentren cubiertos adecuadamente los puntos de ruptura habituales (generalmente intrónicos profundos) en los genes NTRK con el objeto de lograr detectar los genes de fusión. Cabe mencionar que no todos los paneles comerciales de ADN cuentan con cobertura de dichas regiones. A su vez, las regiones intrónicas en genes NTRK2 y NTRK3 presentan un gran tamaño y elementos repetitivos que dificultan la hibridación de las sondas de captura.
De manera similar a lo que ocurre con las técnicas de FISH, un rearreglo a nivel de ADN no garantiza que se genere una proteína funcional, por lo que se prefieren los paneles de ARN, donde se evalúan transcriptos de fusión⁽⁴³⁾.
Los paneles de ARN con estrategias dirigidas permiten evaluar transcriptos de fusión conocidos. Si bien detectan transcriptos de fusión específicos que generan uniones exón-exón entre diferentes genes, por lo general se puede cubrir una inmensidad de posibilidades de fusión, incluso en genes promiscuos, lo que permite incrementar la sensibilidad a niveles cercanos al 100% con alta especificidad.
Otros diseños de paneles de ARN emplean estrategias tales como la Anchored Multiplex PCR (Ej: Archer), que utiliza un cebador específico para los blancos a estudiar (ej: NTRK1/2/3), y cebadores no específicos para poder amplificar fusiones génicas prácticamente con cualquier gen compañero de fusión, incluso compañeros nuevos (o novel) no reportados previamente.
Algunas de las limitaciones son la degradación del ARN por factores preanalíticos y la dificultad para manipular ARN en laboratorios no habituados a estas metodologías⁽⁵⁰⁾.
En el contexto de la evaluación de fusiones de los genes NTRK, los paneles de ARN permiten identificar aquellos rearreglos productivos, capaces de generar transcriptos funcionales. Estas características, han posicionado a los paneles de ARN como preferidos para este tipo de detecciones^{(40, 44, 50, 55)}.

Calidad
El aseguramiento de la calidad en cualquier práctica diagnóstica es fundamental para garantizar a los pacientes la mejor calidad de atención, pero resulta aún más importante en el contexto de estudios de biomarcadores con valor predictivo como las fusiones de los genes NTRK. Las acreditaciones de los laboratorios, las validaciones de cada una de las técnicas diagnósticas disponibles y los controles de calidad externos son pilares fundamentales en este proceso y son criterios exigidos en las guías de buenas prácticas clínicas internacionales⁽⁵⁷⁾.

Algoritmo sugerido de testeo.
La edad de aparición de la patología neoplásica tiroidea es un criterio importante para definir la conducta de testeo. En los pacientes menores de 15 años, el carcinoma papilar de tiroides es la neoplasia más frecuente en la que predominan las fusiones génicas (RET, NTRK3, NTRK1 y ALK, entre otras), y la prevalencia de mutaciones del oncogen BRAF es sumamente baja a diferencia de lo que ocurre en los pacientes mayores de 15 años portadores de este tipo de tumor^{(58, 59)} (Figura 3, Figura 4).
Desde un enfoque pragmático, sería recomendable realizar las técnicas de NGS como orientación diagnóstica inicial en todos los pacientes, utilizando paneles que permitan detectar fusiones, como las que involucran a RET, ALK, MET, etc.⁽⁶⁰⁾.
Sin embargo, y tomando en consideración la heterogeneidad en el acceso a las tecnologías de secuenciación en nuestro país, proponemos un algoritmo que contemple otras técnicas de diagnóstico más difundidas. En pacientes menores de 15 años, la evaluación de rearreglos del RET/PTC y de NTRK es mandatoria. Sin embargo, en los mayores de esta edad, el tamizaje utilizando RT-PCR que ayude a detectar las alteraciones moleculares más prevalentes (BRAF V600E en CPT y NRAS en carcinoma folicular), ayudaría a reducir a la población que requerirá la técnica de NGS (Figura 3, Figura 4).
De acuerdo a la disponibilidad de otras tecnologías como IHQ, FISH o RT-PCR, estas podrán utilizarse como estudios iniciales considerando que, ante un resultado negativo, se recomienda continuar con el estudio de secuenciación por NGS⁽⁴²⁾.

CONCLUSION
En este manuscrito proponemos un camino de decisiones basados en el planteo de la interrogación genómica en el paciente indicado, en el momento apropiado, y con las tecnologías disponibles en el medio en el que se encuentre el profesional médico.
El uso correcto de la metodología diagnóstica mejorará la relación costo-beneficio permitiendo que más individuos con tumores tiroideos avanzados puedan ser interrogados genéticamente y tengan la posibilidad de acceder a estas terapias dirigidas altamente eficaces.

CONFLICTO DE INTERESES
Fabián Pitoia es consultor del laboratorio: Bayer, Roche; Speaker: Bayer; Investigador principal: Roche, Novartis.
Inés Califano es consultora del laboratorio Roche y speaker del laboratorio Bayer.
Federico Jauk es consultor del laboratorio Bayer y speaker de los laboratorios Bayer y Roche.
Hernán García Rivello es consultor y speaker de los laboratorios Bayer y Roche.
Viviana Herzovich no presenta conflictos de interés para esta publicación.